Gram bo'yash usulini bajarishning 3 usuli

2024 Muallif: Jason Gerald | [email protected]. Oxirgi o'zgartirilgan: 2023-12-16 11:45

Gramni bo'yash-bu tezkor usul bo'lib, u hujayra devorlarining kimyoviy va fizik xususiyatlariga qarab, to'qima namunasida bakteriyalar borligini ko'rish va bakteriyalarni grammusbat yoki grammusbat deb tasniflash uchun ishlatiladi. Gram bo'yog'i deyarli har doim bakterial infektsiyani tashxislashda birinchi qadam sifatida ishlatiladi.

Bu binoni usuli Daniya olimi Gans Kristian Gram (1853 - 1938) nomi bilan atalgan, u 1882 yilda texnikani ishlab chiqqan va uni 1884 yilda o'xshash klinik belgilarga ega bo'lgan ikki turdagi bakteriyalarni ajratish usuli sifatida nashr etgan: Streptococcus pneumoniae (shuningdek Streptococcus pneumoniae). Pneumococci) va bakteriyalar Klebsiella pneumoniae.

Qadam

3 -usul 1: mikroskop slaydini tayyorlash

Qadam 1. Laboratoriyada ishlashga tayyorgarlik ko'ring

Siz tekshirayotgan namunaning bakterial ifloslanishiga yo'l qo'ymaslik uchun qo'lqop va uzun sochli galstuk taqing. Ish joyini dudbo'ron ostida yoki boshqa yaxshi gazlangan joyda tozalang. Bunsen yondirgichini tekshiring va ishga tushirishdan oldin mikroskopning to'g'ri ishlashini tekshiring.

Qadam 2. mikroskop oynasini sterilizatsiya qiling

Agar shisha slayd iflos bo'lsa, uni sabunlu suv bilan yuvib, yog 'va axloqsizlikni olib tashlang. Slaydlarni etanol, shisha tozalovchi yoki laboratoriya tomonidan ishlatiladigan boshqa usul bilan tozalang.

Qadam 3. Namunani shisha slaydga joylashtiring

Tibbiy namunadagi bakteriyalarni yoki petri idishida o'sadigan bakteriyalar madaniyatini aniqlashda siz Gramni bo'yash texnikasidan foydalanishingiz mumkin. Eng yaxshi natijaga erishish uchun namunaning ingichka zarbalarida Gram bo'yog'idan foydalaning. Yoshi 24 soatdan kam bo'lgan namunalarni ishlatish maqsadga muvofiqdir, chunki eski bakteriyalar hujayra devorlariga zarar etkazgan bo'lishi mumkin va Gram bo'yashiga javob bermasligi mumkin.

Agar to'qima namunasidan foydalansangiz, shisha slaydga 1-2 tomchi qo'shing. Namuna sepishning yupqa qatlamini hosil qilish uchun slaydga teng ravishda tarqating, uni boshqa steril shisha slaydni chetidan siljiting. Keyingi qadamni bajarishdan oldin uni quriting.
Agar siz petri idishidan bakteriyalar olayotgan bo'lsangiz, Bunsen pechkasida emlash pallasini porlaguncha sterilizatsiya qiling, so'ng sovushini kutib turing. Slaydga steril suv tomizish uchun pastadirdan foydalaning, so'ng bakteriyalarning kichik namunasini yig'ish uchun sterilizatsiya qiling va yana sovuting. Shundan so'ng muloyimlik bilan aralashtiring.
Bulyonda tayyorlangan bakteriyalarni vorteks yordamida yana aralashtirish kerak, keyin suv qo'shmasdan yuqoridagi emlash halqasi bilan olish kerak.
Agar sizda namuna namunasi bo'lsa (odatda paxta uchi kichik tutqich bilan bajarilsa), qo'ltig'ini siljit ustiga tekkizing va sekin aylantiring.

Qadam 4. Biroz yuqori harorat yaxshi bulg'an bo'lishi mumkin

Issiqlik bakteriyalarni slaydning tepasida ushlab turadi, shuning uchun ular binoni jarayonida oson erimaydi. Slaydni Bunsen yondirgichi ustiga ikki -uch marta tez bosing yoki slaydni elektr isitgich orqali qizdiring. Haddan tashqari qizib ketmang, namuna shikastlanishi mumkin. Agar siz Bunsen burneridan foydalansangiz, u katta to'q sariq olov o'rniga kichik, lekin ko'k olov bo'lishi kerak.

Shu bilan bir qatorda, smearni metanol yordamida ham qilish mumkin, quruq smearga 1-2 tomchi metanol qo'shib, qolgan metanolni ochiq havoda qoldirib quritib quriting. Bu usul hujayra shikastlanishini kamaytiradi va slayd tasvirining fonini toza qiladi

Qadam 5. Slaydni rang berish tepsisi ustiga qo'ying

Bo'yash uchun tovoqlar metall, shisha yoki sayoz plastmassalardan yasalgan bo'lib, ustki qismi yumshoq to'r bilan qoplangan. Slaydlarni shu to'rlarning tepasiga qo'ying, shunda siz ishlatadigan suyuqlik laganda ichiga quyiladi.

Agar sizda rang berish tepsisi bo'lmasa, muz kublarini chop etish uchun plastik tovoqlar ustiga slaydni qo'yishingiz mumkin

3 -ning 2 -usuli: Gramni bo'yash jarayoni

1 -qadam. Kristall binafsha rangli suyuqlikni smear ustiga to'kib tashlang

Bakteriyalar namunasini bir necha tomchi billur binafsha bo'yoq bilan purkash uchun pipetkadan foydalaning. 30-60 soniya qoldiring. Kristal binafsha (KV) suvli eritmada KV+ va xlor (Cl-) ionlariga bo'linadi. Bu ionlar grammusbat va grammusbat bakteriyalarning hujayra devorlari va membranalariga kirib boradi. KV+ ioni bakteriyalar hujayralarining manfiy zaryadlangan komponentlari bilan o'zaro ta'sir qilib, hujayralarga binafsha rang beradi.

Ko'pgina laboratoriyalarda yog'ingarchilikning oldini olish uchun ammoniy oksalat bo'lgan "Hucker" billur binafsha rangidan foydalaniladi

Qadam 2. Kristal binafshani muloyimlik bilan yuvib tashlang

Slaydni egib, yuvuvchi shishadan foydalanib, slaydga distillangan yoki musluk suvining kichik oqimini seping. Suv surtma yuzasidan pastga tushishi kerak va uni to'g'ridan -to'g'ri surtma ustiga sepmaslik kerak. Haddan tashqari yuvmang. Gram -musbat bakteriyalardagi dog 'olib tashlashi mumkin.

Qadam 3. Yuzni yod bilan yuving, so'ng yuving

Yog 'tushirish uchun tomizgichdan foydalaning. Uni kamida 60 soniya ushlab turing, keyin yuqoridagi kabi yaxshilab yuving Yod manfiy zaryadlangan ion shaklida KV+ bilan o'zaro ta'sir qilib, Kristal binafsha va yod o'rtasida katta birikma kompleksini hosil qiladi (CV-I birikma kompleksi).) hujayraning ichki va tashqi qatlamlarida. Bu birikmalar majmuasi kristalli binafsha binafsha rangini hujayra ichida, bo'yalgan joylarda saqlaydi.

Yod - korroziy moddadir. Nafas olishdan, yutishdan yoki teri bilan aloqa qilishdan saqlaning

Qadam 4. Rangli oqartgich qo'shing, so'ng tez yuving

Aseton va etanolning 1: 1 nisbatidagi aralashmasi odatda bu muhim qadam uchun ishlatiladi, uni diqqat bilan belgilash kerak. Slaydni ma'lum bir burchakka qo'ying, keyin yuvish uchun ishlatiladigan suvda binafsha rang ko'rinmaguncha rang oqartiruvchi qo'shing. Bu odatda 10 soniyadan kam vaqtni oladi, yoki agar oqartirgichda asetonning yuqori konsentratsiyasi bo'lsa, undan ham kamroq vaqt. Bu qadamni darhol to'xtatib turing, aks holda bo'yoq grammusbat va manfiy hujayralardan kristall binafsha rangni chiqaradi va binoni jarayoni takrorlanishi kerak. Oldingi texnikadan foydalanib, rangdagi oqartiruvchi moddalarni darhol yuving.

Toz aseton (95%+) o'rnini bosishi mumkin. Aseton qancha ko'p ishlatilsa, oqartirish vositasi shunchalik tez ishlaydi, shuning uchun vaqtga ko'proq e'tibor berish kerak.
Agar siz ushbu qadam uchun vaqtni kuzatib borishda qiynalayotgan bo'lsangiz, rang oqartirish vositasini tomchilab qo'shing.

5-qadam. Qarama-qarshi bo'yoqni smear ustiga seping, so'ng yuving

Qarshi dog ', odatda safranin yoki fuchsin, grammusbat va grammusbat bakteriyalar orasidagi kontrastni oshirish uchun ishlatiladi, rangsizlangan (rangsizlangan) bakteriyalarni, ya'ni grammusbat bakteriyalarni pushti yoki qizil rangga bo'yash orqali ishlatiladi. Kamida 45 soniya qoldiring, keyin yuving.

Fuchsin gram-manfiy bakteriyalarni, masalan, Haemophilus spp va Legionella spp. Bu usul yangi boshlanuvchilar uchun yaxshi

Qadam 6. Slaydni quriting

Siz ularni ochiq havoda quritib quritishingiz mumkin, yoki shu maqsadda sotiladigan bibliya qog'ozi yordamida quriting. Gramni bo'yash jarayoni tugadi.

3 -dan 3 -usul: rang berish natijalarini tekshirish

Qadam 1. Nur mikroskopini tayyorlang

Slaydni mikroskop ostiga qo'ying. Bakteriyalar hajmi jihatidan juda farq qiladi, shuning uchun umumiy kattalashtirish 400x dan 1000xgacha o'zgaradi. Tasvirni aniqroq tasvirlash uchun suvga moylangan ob'ektiv linzalar tavsiya etiladi. Pufakchalar paydo bo'lishining oldini olish uchun tomchilayotganda harakat qilmaslik uchun suvga cho'mish yog'ini tushiring. Ob'ektiv linzalari joyiga tushishi va moyga tegishi uchun mikroskopning tutqichini harakatlantiring.

Yog 'botirishni faqat maxsus qurilgan linzalarda ishlatish mumkin, "quruq" linzalarda emas

Qadam 2. Gram -musbat va gram -manfiy bakteriyalarni aniqlashga harakat qiling

Slaydni yorug'lik mikroskopi ostida tekshiring. Gram-musbat bakteriyalar binafsha rangga o'xshaydi, chunki binafsha binafsha rang qalin hujayra devorida joylashgan. Gram-manfiy bakteriyalar pushti yoki qizil rangga ega bo'ladi, chunki binafsha rang yupqa hujayra devorlari orqali yuviladi, u erga pushti qarshi bo'yoq kiradi.

Agar namuna juda qalin bo'lsa, natija noto'g'ri ijobiy bo'lishi mumkin. Agar natija to'g'ri ekanligiga ishonch hosil qilish uchun, agar u barcha grammusbat bakteriyalarni ko'rsatsa, yangi namunani bo'yab tashlang.
Agar siz juda ko'p rang oqartirish vositasidan foydalansangiz, natija noto'g'ri salbiy bo'lishi mumkin. Agar natija to'g'riligiga ishonch hosil qilish uchun gramm -manfiy bakteriyalar bo'lsa, yangi namunani bo'yab tashlang.

Qadam 3. Siz ko'rgan natijalarni mos yozuvlar tasviri bilan solishtiring

Agar siz bakteriyalar qanday ko'rinishini bilmasangiz, odatda shakli va gramm dog 'bo'yicha saralangan mos yozuvlar rasmlari to'plamini o'rganing. Siz shuningdek onlayn ma'lumotlar bazalarini [Milliy mikroblar patogenlari ma'lumotlar bazasi, fotosuratlardagi bakteriyalar va boshqa ko'plab onlayn saytlarda ko'rishingiz mumkin. Identifikatsiyani osonlashtirish uchun quyida tez -tez uchraydigan yoki tashxis qo'yish uchun muhim bo'lgan bakteriyalar misollari, ularning gramm holati va shakli bo'yicha tasniflanadi.

4-qadam. Gram-musbat bakteriyalarni shakliga qarab aniqlang

Bakteriyalar mikroskop ostida shakliga ko'ra tasniflanadi, odatda kokklar (sharsimon) yoki tayoqlar (silindrsimon). Mana, grammusbat bakteriyalarga (binafsha rang) shakliga qarab misollar:

Gram -musbat kokklar odatda stafilokokklar (kokklar guruhini bildiradi) yoki streptokokklar (zanjirli kokklar ma'nosini bildiradi).
Bacillus, Clostridium, Corynebacterium va Listeria kabi gram -musbat tayoqlar. Rod bakteriyalari Actinomyces spp. odatda filiallari yoki filamentlari bor.

Qadam 5. Gram -manfiy bakteriyalarni aniqlang

Gram-manfiy bakteriyalar (pushti rang) ko'pincha uch guruhga bo'linadi. Kokklar sharsimon shaklda, novdalari uzun va ingichka, oralarida kokkodlar bor.

Gram -manfiy kokklar Eng keng tarqalgani Neisseria spp.
Gram-manfiy tayoqlar Masalan, E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Proteus, Salmonella, Shigella, Pseudomonas va boshqalar. Vibrio vaboni oddiy yoki egilgan poyasi sifatida ko'rish mumkin.
Gram-manfiy "coccoid" (yoki "coccobacilli") tayoqchali bakteriyalar Masalan, Bordetella, Brucella, Haemophilus va Pasteurella

Qadam 6. Natijalar aralashganligini diqqat bilan tekshiring

Ba'zi bakteriyalarni hujayra devorlarining mo'rtligi yoki mumsimonligi tufayli aniq rang berish qiyin. Bu bakteriyalar bitta hujayrada yoki bir xil smearda turli hujayralar orasida binafsha yoki pushti ranglarning aralashmasini ko'rsatishi mumkin. 24 soatdan katta bakteriyalar namunalari bu muammoni ko'rsatishi mumkin, lekin har qanday namuna olish yoshida rang berish qiyin bo'lgan bakteriyalar turlari ham bor. Bu bakteriyalar identifikatsiyalash uchun ko'proq maxsus testlarni talab qiladi, masalan, kislotaga tez bo'yash, bakterial madaniyatda kuzatish, TSI madaniy muhit yoki genetik test.

Actinomyces, Arthobacter, Corynebacterium, Mycobacterium va Propionibacterium spp. Hammasi gram-musbat bakteriyalar, lekin ko'pincha aniq bo'yalgan emas.
Treponema, Chlamydia va Rickettsia spp kabi mayda, nozik bakteriyalar. Gram usuli bilan bo'yash qiyin.

Qadam 7. Qolgan sarf materiallari va uskunalarni yo'q qiling

Chiqindilarni utilizatsiya qilish tartibi laboratoriyalarda farq qiladi va ishlatilgan materiallarga bog'liq. Odatda, binoni tepsisidagi suyuqlik xavfli chiqindilar deb belgilangan butilkalarga tashlanadi. Slaydlarni 10% oqartuvchi eritmada namlang, so'ngra o'tkir konteynerga tashlang.

Maslahatlar

Shuni esda tutingki, Gram dog 'natijalari faqat namuna yaxshi bo'lganda yaxshi bo'ladi. Yaxshi namuna olishlari uchun bemorlarni xabardor qilish juda muhim (masalan, balg'am namunasini olish uchun tupurish va chuqur yo'tal o'rtasidagi farq).
Rangli sayqallash vositasi sifatida etanol asetonga qaraganda sekinroq reaksiyaga kirishadi.
Xavfsizlikni ta'minlash uchun standart laboratoriya qoidalariga rioya qiling.
Yonoqlarni qo'llang, chunki gramm-musbat va gram-manfiy bakteriyalarni o'z ichiga oladi. Agar siz faqat bitta turdagi bakteriyalarni ko'rsangiz, siz juda oz yoki ko'p miqdorda oqartuvchi vositalarni ishlatgan bo'lishingiz mumkin.
Slaydni mahkamlash uchun yog'och qisqichlardan foydalanishingiz mumkin.

Ogohlantirish

Aseton va etanol yonuvchan moddalardir. Aseton sizning qo'lingizdan yog'ni olib tashlaydi, bu sizning teringizga boshqa kimyoviy moddalarni singdirishni osonlashtiradi. Qo'lqop kiying va ularni ehtiyotkorlik bilan ishlating.
Gram yoki qarshi bo'yoqni yuvishdan oldin bulg'angan joyning qurib ketishiga yo'l qo'ymang.